ఆల్కలీన్ ప్రోటీజ్

అప్లికేషన్ మరియు సూత్రం

ఈ ఆల్కలీన్ ప్రోటీజ్ బాసిల్లస్ సబ్టిలిస్ వర్ నుండి పొందిన సన్నాహాల యొక్క పిసి యూనిట్లుగా వ్యక్తీకరించబడిన ప్రోటీజ్ కార్యాచరణను నిర్ణయించడానికి ఉపయోగిస్తారు. మరియు బాసిల్లస్ లైకనిఫార్మిస్ వర్. 37 ° మరియు pH 7.0 వద్ద కేసైన్ యొక్క 30-నిమిషాల ప్రోటోలిటిక్ జలవిశ్లేషణపై ఈ పరీక్ష ఆధారపడి ఉంటుంది. వడపోత ద్వారా అన్‌హైడ్రోలైజ్డ్ కేసైన్ తొలగించబడుతుంది మరియు కరిగే కేసిన్ స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రిక్‌గా నిర్ణయించబడుతుంది.

ఆల్కలీన్ ప్రోటీజ్ యొక్క కారకాలు మరియు పరిష్కారాలు
కాసిన్ యూజ్ హమ్మర్‌స్టన్-గ్రేడ్ కేసిన్ (యునైటెడ్ స్టేట్స్ బయోకెమికల్ కార్పొరేషన్, కాటలాగ్ నం. 12840, లేదా సమానమైనది).
ట్రిస్ బఫర్ (పిహెచ్ 7.0) 12.1 గ్రా ఎంజైమ్-గ్రేడ్ (లేదా సమానమైన) ట్రిస్ (హైడ్రాక్సీమీథైల్) అమినోమీథేన్‌ను 800 ఎంఎల్ నీటిలో కరిగించి, 1 ఎన్ హైడ్రోక్లోరిక్ ఆమ్లంతో పిహెచ్ 7.0 కు టైట్రేట్ చేయండి. 1000-ఎంఎల్ వాల్యూమెట్రిక్ ఫ్లాస్క్‌లోకి బదిలీ చేయండి, నీటితో వాల్యూమ్‌తో కరిగించి, కలపాలి.
టిసిఎ సొల్యూషన్ 1000-ఎంఎల్ వాల్యూమెట్రిక్ ఫ్లాస్క్‌లో 800 ఎంఎల్ నీటిలో 18 గ్రా ట్రైక్లోరోఅసెటిక్ ఆమ్లం మరియు 19 గ్రా సోడియం అసిటేట్ ట్రైహైడ్రేట్‌ను కరిగించి, 20 ఎంఎల్ హిమనదీయ ఎసిటిక్ ఆమ్లాన్ని జోడించి, నీటితో వాల్యూమ్‌లో పలుచన చేసి కలపాలి.
సబ్‌స్ట్రేట్ సొల్యూషన్ 6.05 గ్రా ఎంజైమ్-గ్రేడ్ ట్రిస్ (హైడ్రాక్సీమీథైల్) అమినోమెథేన్‌ను 500 ఎంఎల్ నీటిలో కరిగించి, 1 ఎన్ హైడ్రోక్లోరిక్ ఆమ్లంలో 8 ఎంఎల్ వేసి కలపాలి. ఈ ద్రావణంలో 7 గ్రా కేసిన్ కరిగించి, 30 నిమిషాలు వేడినీటి స్నానంలో వేడి చేసి, అప్పుడప్పుడు కదిలించు.
గది ఉష్ణోగ్రతకు చల్లబరుస్తుంది మరియు 0.2 N హైడ్రోక్లోరిక్ ఆమ్లంతో pH 7.0 కు సర్దుబాటు చేయండి, కేసిన్ యొక్క అవపాతం నివారించడానికి ఆమ్లాన్ని నెమ్మదిగా, తీవ్రమైన గందరగోళంతో కలుపుతుంది. మిశ్రమాన్ని 1000-ఎంఎల్ వాల్యూమెట్రిక్ ఫ్లాస్క్‌లోకి బదిలీ చేయండి, నీటితో వాల్యూమ్‌తో కరిగించి, కలపాలి.

ట్రిస్ బఫర్ ఉపయోగించి నమూనా తయారీ, నమూనా ఎంజైమ్ తయారీ యొక్క పరిష్కారాన్ని సిద్ధం చేయండి, తద్వారా 2 ఎంఎల్ తుది పలుచన 10 మరియు 44 బాక్టీరియల్ ప్రోటీజ్ యూనిట్ల మధ్య ఉంటుంది.

ఆల్కలీన్ ప్రోటీజ్ యొక్క విధానం
25- × 150-మిమీ పరీక్షా గొట్టాల శ్రేణిలోకి సబ్‌స్ట్రేట్ సొల్యూషన్ యొక్క పైపెట్ 10.0 ఎంఎల్, ప్రతి ఎంజైమ్ పరీక్షకు ఒక ట్యూబ్, ప్రతి ఎంజైమ్ ఖాళీగా ఒక ట్యూబ్ మరియు ఖాళీగా ఉన్న ఒక ట్యూబ్‌ను అనుమతిస్తుంది. 37 ± ± 0.1 at వద్ద నిర్వహించబడే నీటి స్నానంలో గొట్టాలను 15 నిమిషాలు సమతుల్యం చేయండి.
సున్నా సమయంలో స్టాప్‌వాచ్‌ను ప్రారంభించి, సమతుల్య ఉపరితలంలోకి నమూనా తయారీ యొక్క 2.0 ఎంఎల్‌ను వేగంగా పైప్ చేయండి. కలపండి, మరియు నీటి స్నానంలో గొట్టాలను భర్తీ చేయండి. 2 mL ట్రిస్ బఫర్ (నమూనా తయారీకి బదులుగా) సబ్‌స్ట్రేట్‌కు ఖాళీగా జోడించండి. సరిగ్గా 30 నిమిషాల తరువాత, ప్రతి ఎంజైమ్ ఇంక్యుబేషన్‌కు 10 ఎంఎల్ టిసిఎ సొల్యూషన్‌ను జోడించండి మరియు ప్రతిచర్యను ఆపడానికి సబ్‌స్ట్రేట్ ఖాళీగా ఉంటుంది. ప్రోటీన్ పూర్తిగా గడ్డకట్టడానికి అదనపు 30 నిమిషాలు నీటి స్నానంలో గొట్టాలను వేడి చేయండి.
రెండవ తాపన కాలం చివరిలో, ప్రతి గొట్టాన్ని తీవ్రంగా కదిలించండి మరియు 11-సెం.మీ వాట్మాన్ నం 42, లేదా సమానమైన, ఫిల్టర్ పేపర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేయండి, మొదటి 3 ఎంఎల్ ఫిల్ట్రేట్‌ను విస్మరిస్తుంది.
[గమనిక: ఫిల్ట్రేట్ ఖచ్చితంగా స్పష్టంగా ఉండాలి.]
ప్రతి నమూనా ఫిల్ట్రేట్ యొక్క శోషణను 1-సెం.మీ కణంలో, 275 ఎన్ఎమ్ వద్ద, తగిన స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్‌తో నిర్ణయించండి, పరికరం సున్నా వద్ద సెట్ చేయడానికి సబ్‌స్ట్రేట్ ఖాళీ నుండి ఫిల్ట్రేట్‌ను ఉపయోగించి. తగిన ఎంజైమ్ ఖాళీ పఠనాన్ని తీసివేయడం ద్వారా ప్రతి పఠనాన్ని సరిచేయండి మరియు AU గా పొందిన విలువను రికార్డ్ చేయండి.

స్టాండర్డ్ కర్వ్ 100.0 మి.గ్రా ఎల్-టైరోసిన్, క్రోమాటోగ్రాఫిక్-గ్రేడ్ లేదా సమానమైన (ఆల్డ్రిచ్ కెమికల్ కో.), గతంలో స్థిరమైన బరువుకు ఎండబెట్టి, 1000-ఎంఎల్ వాల్యూమెట్రిక్ ఫ్లాస్క్‌కు బదిలీ చేయండి. 0.1 N హైడ్రోక్లోరిక్ ఆమ్లం యొక్క 60 mL లో కరిగించండి. పూర్తిగా కరిగినప్పుడు, ద్రావణాన్ని నీటితో కరిగించి, పూర్తిగా కలపాలి. ఈ ద్రావణంలో 1.0 mL లో 100 µg టైరోసిన్ ఉంటుంది. ఈ స్టాక్ ద్రావణం నుండి మరో మూడు పలుచనలను ఎంఎల్‌కు 75.0, 50.0, మరియు 25.0 µg టైరోసిన్ కలిగి ఉండండి. 0.006 N హైడ్రోక్లోరిక్ ఆమ్లానికి వ్యతిరేకంగా తగిన స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్‌పై 1-సెం.మీ కణంలో 275 nm వద్ద నాలుగు పరిష్కారాల శోషణను నిర్ణయించండి. టైరోసిన్ ఏకాగ్రతకు వ్యతిరేకంగా శోషణ ప్లాట్లు సిద్ధం చేయండి.

ఆల్కలీన్ ప్రోటీజ్ యొక్క లెక్కింపు
ఒక బ్యాక్టీరియా ప్రోటీజ్ యూనిట్ (పిసి) ఎంజైమ్ యొక్క పరిమాణంగా నిర్వచించబడింది, ఇది పరీక్షా పరిస్థితులలో నిమిషానికి 1.5 µg / mL ఎల్-టైరోసిన్ సమానంగా ఉత్పత్తి చేస్తుంది.
ప్రామాణిక వక్రత నుండి, మరియు ఇంటర్పోలేషన్ ద్వారా, 60 µg / mL టైరోసిన్ గా ration త కలిగిన పరిష్కారం యొక్క శోషణను నిర్ణయించండి. 0.0115 కి దగ్గరగా ఉన్న బొమ్మను పొందాలి. 1.5 µg / mL టైరోసిన్ గా ration త కలిగిన ద్రావణానికి సమానమైన శోషణను పొందటానికి ఇంటర్పోలేటెడ్ విలువను 40 ద్వారా విభజించండి మరియు AS గా పొందిన విలువను రికార్డ్ చేయండి.
సమీకరణం ద్వారా నమూనా ఎంజైమ్ తయారీ యొక్క కార్యాచరణను లెక్కించండి

PC / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

దీనిలో 22 అనేది ప్రతిచర్య మిశ్రమం యొక్క mL లో తుది వాల్యూమ్; 30 ప్రతిచర్య యొక్క సమయం, నిమిషంలో; మరియు W అనేది g లో, తీసుకున్న అసలు నమూనా యొక్క బరువు.

ఆల్కలీన్ ప్రోటీజ్ యొక్క ప్యాకేజింగ్ మరియు నిల్వ

సాలిడ్ ఫుడ్ ప్యాకేజింగ్ బ్యాగ్, 25 కిలోలు / బ్యారెల్.

ఆల్కలీన్ ప్రోటీజ్ ఎండ, వేడి నుండి దూరంగా పొడి, చల్లని మరియు బాగా వెంటిలేషన్ ప్రదేశాలలో నిల్వ చేయాలి.

చెల్లింపు:టి / టి, పేపాల్, వెస్ట్రన్ యూనియన్, అలీబాబా ట్రేడ్ అస్యూరెన్స్, వీసా, మాస్టర్ కార్డ్, ఇ-చెకింగ్, తరువాత చెల్లించండి, ఎల్‌సి మరియు మొదలైనవి.